除病毒验证：以过载模式操作的阳离子交换层析可有效去除病毒

来自日本第一三共制药公司等的科研人员在2019年5月的《Biotechnology Progress》杂志上发表了题为“Cation Exchange Chromatography Performed in Overloaded Mode is Effective in Removing Viruses During the Manufacturing of Monoclonal Antibodies”的文章。

文中，科研人员指出在使用哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，进行单克隆抗体（mAb）产品的生产中，病毒性安全是一个关键考量因素。生产商被要求在下游纯化步骤中，通过除病毒验证，确认此类产品的安全性。在mAb纯化中，以结合/洗脱模式进行的阳离子交换（CEX）层析，被广泛用作精制步骤。但是，结合/洗脱模式要求使用大体积的昂贵填料。为降低生产成本，最近有研究人员开发了以过载模式进行的CEX层析，并报导其可有效去除宿主细胞蛋白质（HCP）、宿主细胞DNA、高分子量物质（HMWS）以及脱落的Protein A，但是过载模式中的除病毒应用尚未有报导。

原文研究使用小鼠白血病病毒（MLV）评估了过载模式中的除病毒能力。结果显示，即使在高负载条件下，如2,000g mAb/L填料，MLV可被从mAb溶液中去除，且除病毒能力不受填料类型和mAb类型的显著影响。过载模式还可从mAb溶液中去除其它类型的病毒，如伪狂犬病毒和呼肠孤病毒3型。基于这些结果，可认为，经济有效的过载模式在除病毒方面与结合/洗脱模式相当。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

简介

病毒性安全是以哺乳动物细胞，如CHO细胞，进行mAb产品生产时的关键考量因素。CHO细胞表达非感染性逆转录病毒样颗粒。生产商被要求需使外源性病毒污染的可能性最小化。此外，生产商必须证明在纯化步骤中，外源性病毒和逆转录病毒样颗粒被去除或灭活。CEX层析以结合/洗脱模式被广泛用作精制步骤，以去除HMWS、HCP和脱落的protein A，使其降至可接受的水平。CEX层析可去除诸如小鼠白血病病毒（MLV）的病毒，后者也常被用作逆转录病毒、伪狂犬病毒（PRV）和3型呼肠孤病毒（Reo3）的模式病毒。

CEX层析以结合/洗脱模式进行操作要求使用大体积的昂贵填料，以结合所有的mAb分子和特定的杂质。为降低CEX层析的成本，新近有研究人员开发了过载模式。尽管CEX层析以结合/洗脱模式进行操作时，上样条件需处于动态结合载量范围内，例如<100g mAb/L填料，过载模式可上样达1,000g mAb/L 填料。

实验

病毒挑战实验和病毒分析

病毒挑战实验和病毒分析在BioReliance实验室进行。病毒滴度按BioReliance针对每种模式病毒和特定指示细胞的标准操作程序，使用可靠的定量感染性分析方法（50%组织培养感染量 [TCID50]）确定：PG-4细胞（MLV）、Vero细胞（PRV）、324K细胞（MMV）以及L-929细胞（Reo3）。病毒挑战实验使用规模缩小（Scale-down）模型进行。上样物料、上样保留、洗脱馏分以及产品池的滴度使用TCID50确定。使用病毒滴度和产物体积计算对数降低值（LRV）。

CEX层析方法：过载模式和结合/洗脱模式

为评估过载模式中的HMWS和HCP去除，Repligen Valichrom™预装柱（0.5cm I.D. x 5 cm 柱床高度，柱体积CV=1mL）预装POROS XS填料。对于病毒挑战研究，使用相同尺寸的POROS XS、Eshmuni CPX和Capto S ImpAct预装柱。通常，过载模式在结合/洗脱模式中通常使用的结合条件下操作。在本研究中，对于过载模式，使用的条件基于之前mAb纯化研究和每种填料生产商提供的性能数据。CEX层析柱用pH 5.0的50 mM醋酸缓冲液平衡，然后CEX上样物料上样至层析柱，达到2,000g mAb/L填料。上样后，层析柱内的mAb用平衡缓冲液回收。使用含有1M 氯化钠的高盐缓冲液从层析柱中淋洗出所有物料。

对于结合/洗脱模式，POROX XS、Eshmuno CPX和Capto S ImpAct预装成0.8 cm I.D. x 20 cm柱床高度ValiChrom™预装柱（CV = 10mL），流速设置为15 CV/h (RT=4min)。CEX层析柱以pH 5.0的20mM 醋酸缓冲液平衡，然后，CEX上样物料上样至层析柱，达85g mAb/L填料，以平衡缓冲液漂洗，并以含有170mM （mAb2）或180mM （mAb1）氯化钠的50 mM醋酸缓冲液洗脱。

为分析结合/洗脱模式中的病毒洗脱液特性，使用一根预装POROX XS的ValiChrom™预装柱，0.8cm I.D. x 20 cm柱床高度（CV=10mL），流速设置为15 CV/h (RT=4min)。CEX层析柱以pH 5.0的50 mM醋酸缓冲液平衡，然后CEX上样物料上样至层析柱，达25g mAb1/L 填料，以平衡缓冲液漂洗，以步进式梯度洗脱，每一步使用5CV。

为评估每种填料的动态结合载量，纯化的mAb1以15CV/h (RT=4min)上样，直到洗脱液中的蛋白质浓度与上样浓度相等。每种填料的动态结合载量按结合流穿的5%计算。

详细的实验材料、结果分析方法以及结果讨论，请参考原文。

鉴于本研究证实的以过载模式操作的CEX层析的除病毒能力，即mAb样品中的所有主要杂质，包括HMWS、HCP以及病毒颗粒，可通过以过载模式操作的CEX层析去除，说明过载模式可有效用作精制步骤，进行治疗性mAb的工艺处理。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：Y.Masuda, M.Tsuda, C.Hahikawa-Muto, et al., Cation Exchange Chromatography Performed in Overloaded Mode is Effective in Removing Viruses During the Manufacturing of Monoclonal Antibodies. Biotechnology Progress, 2019, DOI: 10.1002/btpr.2858.

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